不同治则方药对痴呆动物脑组织细胞因子影响研究-护理研究开题报告论文

护理研究开题报告论文        医学护理论文      临床护理论文       心内科护理论文
1  材料与仪器
  1.1  动物
  SPF级7月龄雄性快速老化小鼠(senescence accelerated mouse,SAM)购自天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心(动物质量合格证号:06F1022),其中快速老化亚系SAM-prone/8(SAMP8)小鼠84只,抗快速老化亚系SAM-resistant/1(SAMR1)小鼠15只,体质量约20 g。
  1.2  药品和试剂
  六味地黄汤(熟地、山萸肉、山药、泽泻、丹皮、茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3的比例配比);归脾汤(白术、茯苓、黄芪、龙眼肉、酸枣仁、木香、炙甘草、当归、远志、人参按3∶3∶4∶4∶4∶2∶1∶3∶2∶2的比例配比);四君子汤(人参,白术,茯苓,炙甘草按1∶1∶1∶1的比例配比);当归芍药散(当归,芍药,川芎,泽泻,白术,茯苓按3∶16∶8∶8∶4∶4的比例配比)等4种方药药材由广东省中医院药房提供,按煎煮标准配制,煎煮浓缩至所需浓度(含生药为1 g/ml);脑复康片(吡拉西坦片Piracetam Tablets),广东华南药业有限公司产品,批号:051103;氯化钠灭菌注射液,广州中医药大学附属第一医院产品,批号:T051123; Mouse Multi-Cytokine Detection System2 Luminex检测试剂盒,Upstate公司产品,批号:0604026780。
  1.3 仪器
  液相芯片分析平台(美国Luminex公司,型号Luminex100);超低温冰箱(美国Forma公司,型号8525);台式高速冷冻离心机(德国Beckman公司,型号GS-15R);电子天平(日本Shimadzu公司,型号AGE120);纯水器(美国Millipore公司,型号Milli-Q)。
  2  方法
  2.1  分组
  84只7月龄SAMP8小鼠按区组随机法分为模型组、脑复康组、六味地黄汤组、四君子汤组、归脾汤组、当归芍药散组,每组14只;15只SAMR1作为正常对照组。以各种药物的临床用量作为实验小鼠的用药量,根据体重剂量浓度的换算公式[3]换算成小鼠标准体重剂量,按下列分组连续灌胃给药4周。
  2.2  给药
  ① 正常对照组:每天给予生理盐水灌胃,0.2 m1/次。 ② 模型组:每天给予生理盐水灌胃,0.2 m1/次。 ③ 六味地黄汤组(0.2 g/20 g)、四君子汤组(0.09 g/20 g)、归脾汤组(0.23 g/20 g)、当归芍药散组(0.34 g/20 g),每天分别按相应的剂量(生药/体重)灌胃。 ④ 脑复康组(阳性药对照):每天给予脑复康片生理盐水溶液灌胃,按 0.5 g/kg体重给药。
  2.3 标本制备
  各组8月龄SAM小鼠灌胃治疗后,断头取出其双侧海马和双侧皮质作为样本,分离海马组织时参照本室[4]的方法,取出双侧海马放置于0.5 ml的Eppendorf管内,称重,封口,置于-70℃超低温冰箱保存备用。
  2.4 液相蛋白芯片(Luminex)技术检测
  脑组织标本正式检测前从-70℃超低温冰箱取出,以每克组织加入15 ml磷酸盐缓冲液(PBS)的比例,加入0.01 mol/L PBS(内含苯甲基氟磺酸100 mg/L)液,在微型组织研磨器中充分研磨,3 000 g,4℃离心10 min,待测。严格按Upstate公司的Luminex检测试剂盒说明书进行操作。先将50 μl的空白对照缓冲液、不同稀释倍数的标准品和待测样品分别加到可抽滤的96孔微孔板对应孔内,然后加入25 μl抗体交联微球进行反应,室温振荡4 h后,4℃过夜;次日进行真空低压抽滤、缓冲液洗涤,加25μl检测抗体进行反应;室温振荡1.5 h,加入25 μl链亲和素-藻红蛋白荧光素进行标记;室温振荡30 min,加25 μl终止液终止反应,上Luminex 分析平台进行检测。检测完毕后,采用美国MiraiBio公司的MasterPlexTMQT多元数据分析软件(随Luminex 分析平台安装),绘制标准曲线,用四参数法换算出各细胞因子的含量。
  3  结果
  与正常对照组比较,模型组除了IL-6和IL-10有下降趋势外,其余8种细胞因子含量均呈升高趋势,但只有GM-CSF的含量明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察各药物治疗组对皮质GM-CSF的影响发现,六味地黄汤组、当归芍药散和阳性对照药脑复康的GM-CSF含量均与正常对照组水平接近(P>0.05),而四君子汤组和归脾汤组则和模型组一样,明显高于正常对照组(P<0.05或P<0.01)。说明前3种药物能在一定程度上抑制SAMP8小鼠皮质GM-CSF含量的升高。
  与正常对照组比较,8月龄SAMP8小鼠所有10种细胞因子含量均呈下降趋势,除了TNF-α和IL-5外,其余8种细胞因子含量均明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果提示8月龄SAMP8小鼠脑组织中某些细胞因子表达发生了异常改变。从不同药物组对8月龄SAMP8小鼠海马匀浆液10种细胞因子的影响结果发现,阳性对照药脑复康能提高模型小鼠海马中的IFN-γ,IL-4和IL-12的水平(P<0.05或P<0.01);当归芍药散能提高模型小鼠海马中的IFN-γ和IL-4的水平(P<0.05);四君子汤组也能提高模型小鼠海马中的IFN-γ水平(P<0.05);而六味地黄汤组则能使模型小鼠海马中的GM-CSF,IFN-γ,TNFα,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12等10种细胞因子指标全部显着升高(P<0.05或P<0.01),大多恢复到正常水平。结果表明当该时期SAMP8小鼠海马中的免疫机制出现异常反应时,中药复方六味地黄汤、当归芍药散、四君子汤以及阳性对照药脑复康均能起到一定的调节作用,其中六味地黄汤的作用效果较明显。
  本实验研究拟采用新引进的液相蛋白芯片(Luminex)技术[2],研究不同治则方药对痴呆动物模型脑组织细胞因子的影响。首先在文献检索和预实验的基础上,初筛出10种与AD免疫炎症病理反应相关的细胞因子,它们是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granuloyte-macrophage colony stimutaing factor, GM-CSF)、γ-干扰素(Interferon γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12);然后用4种不同治则的经典方药(即六味地黄汤、归脾汤、当归芍药散和四君子汤)对痴呆动物模型进行治疗;应用Luminex检测技术,比较不同治则方药各自不同蛋白表达靶点(脑组织的皮质和海马)的细胞因子含量变化,从炎症与免疫反应方面阐述中药复方防治AD的药理机制,为其临床应用提供实验依据。
护理研究发烧综述论文         http://www.360qikan.com/