《四川大学学报(医学版)》波动性高糖对人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响

  糖尿病心血管并发症是危害人类健康和生命安全的严重疾患,虽然多年来在研究和认识这一系列病变的领域取得了长足的进展,但其内在复杂机制仍不明了。当前的观点认为,糖尿病是一种慢性系统性炎性疾病,其进展特征伴随一系列具备多效生物学活性的炎症因子的激活,包括细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule.1,ICAM.1)、白介素.6(interleukin-6,IL.6)和肿瘤坏死因子 d(tumonecrosis factor-Ot,TNF一仅)等。血糖波动目前被认为是独立于血糖水平和糖化血红蛋白的第三种糖尿病糖代谢异常状况。不断有临床研究表明,异常升高的血糖波动会放大机体氧化应激反应,并且和心血管不良预后密切相关 引。体外实验也证明波动性高糖培养的血管内皮细胞其氧化应激程度较在持续性高糖环境培养下明显增强,细胞凋亡趋势显着增加 。但关于波动性高糖环境下血管内皮细胞的局部炎症反应,迄今仍未见报道。本实验以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)为研究对象,探讨体外模拟波动性高糖对内皮细胞炎症反应的影响。

  1 材料与方法

  1.1 主要材料 RMPI一1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司;HUVEC细胞株、IL-6、TNF一 和ICAM.1 ELISA检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司。实时定量PCR扩增试剂盒购白日本TOYO—BO公司。

  1.2 细胞培养及分组取HUVEC接种于含胎牛血清的RMPI.1640培养液中,置于37℃ 、含5%CO 的饱和湿度培养箱中培养,细胞呈单层贴壁生长后,每2 d更换培养液1次,每2~3 d传代一次。

  培养12 h后将细胞依培养条件不同分为4组:第1组,正常葡萄糖组(normal glucose,NG),葡萄糖浓度为5.0 mmol/L;第2组,持续性高糖组(persistenthigh glucose,PHG),葡萄糖浓度为25 mmol/L;第3组,波动性高糖组(oscillating high glucose,OHG)葡萄糖浓度为5.0 mmol/L和25 mmoL/L,每24 h更替;第4组,渗透压对照组(osmotic control,OC),不加入葡萄糖,加入不同量甘露醇控制渗透压,操作同波动性高糖组。

  1.3 IL.6、TNF—OL和ICAM.1蛋白测定在HUVEC培养于不同葡萄糖水平7 d后,测定细胞培养液中IL.6、TNF-α和ICAM.1蛋白浓度,具体操作见厂家技术说明书。

  1.4 实时定量PCR分析在HUVEC暴露于不同葡萄糖水平7 d后按说明书进行实时定量PCR扩增测定IL.6、TNF一仅和ICAM.1的mRNA表达。使用Tfizol试剂提取细胞总RNA,经纯化后反转录为单链cDNA,再利用实时定量PCR测定。扩增过程包括95°C 5 min、95°C 15 S、60°C 20 S和72°C 40 S,共40个循环。

  1.5 统计学处理采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理,正态分布的计量数据以均数±标准差(±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 不同葡萄糖环境下HUVEC的IL.6、TNF.仪和ICAM一1蛋白表达差异 在不同葡萄糖浓度环境集中连续培养7 d后,与NG组和OC组比较,PHG组IL-6、TNF一仅和ICAM一1蛋白水平显着升高(P<0.05),而OHG组较其他3组上述炎症因子升高更为显着(P<0.05)。

  2.2 不同葡萄糖环境下HUVEC的IL-6、TNF-d和ICAM一1的mRNA表达差异 在连续7 d培养后,PHG组的HUVEC的IL.6、TNF一仪和ICAM-1 mRNA表达显着高于NG组和OC组(P<0.05),而OHG组较所有其他组均明显升高(P<0.05)。

  3 讨论血糖波动异常对于人体慢性代谢性疾病的影响已引起广泛关注,其和心血管不良预后的密切关系更是愈来愈受到国内外专家的重视。炎症反应全程参与糖尿病及其心血管并发症的发生发展已得到公认,炎症因子已成为评估糖尿病患者罹患动脉粥样硬化风险的重要生物学标志。在住院患者中,高血糖已被证明能够触发包括IL-6、TNF-α和黏附分子等炎症因子的过表达。作为白细胞介素家族的重要成员之一,IL-6可以由多种细胞合成分泌并作用于一系列组织和器官。有研究表明IL一6水平为冠心病的一个独立危险因素 ,而且实验研究也证明其在动脉粥样硬化中的作用。在本实验中,暴露于持续性高糖环境的HUVEC的IL一6的分泌量明显高于NG及OC组,而这一差异在波动性高糖中则更为明显。我国学者在体外波动性高糖环境下培养的人巨噬细胞中亦观察到类似趋势,但本实验结果中波动性高糖诱导HUVEC表达IL一6的作用较单核细胞更强,这可能和本实验选择了不同的细胞来源有关。

  本实验同时测定了不同葡萄糖环境下TNF一仅的表达量,持续性高糖可以显着升高HUVEC的TNF-α分泌,而波动性高糖环境下其分泌量进一步增加。TNF-α是一种多功能炎症因子,它在介导糖尿病大血管并发症发生中发挥重要作用。TNF-α水平升高亦被证明和老年患者动脉粥样硬化高发生率密切相关。更值得注意的是,Esposito等发现急性高血糖可以诱导TNF- 水平升高,而这一作用则会被抗氧化剂谷胱甘肽完全消除。这些发现提示血糖骤升在短期内对于细胞因子浓度的影响可能要超过持续性高血糖。本文研究结果表明,波动性高糖较之持续性高糖更易引起TNF. 的高表达。作为一种重要的自分泌和内分泌器官,血管内皮部分通过调节血管局部炎症反应来维持内皮功能的稳定。血管内皮细胞过多分泌的TNF-α不仅可以加入机体循环,还可以作用于自身,从而产生一种恶性生物反馈作用。

  本实验中可溶性细胞问黏附因子在不同葡萄糖培养液中含量亦不相同,其中以波动性高糖培养基中浓度最高。ICAM一1是一种重要的细胞黏附分子,部分由内皮细胞合成,往往出现在冠状动脉受损部位。糖尿病患者较无糖尿病患者可溶性ICAM—l水平更高。从本实验的结果可以看出,以ICAM.1过表达为特征的局部血管炎性反应的增强可能参与白细胞的跨膜迁移。因此,可认为波动性高糖促进了炎症介导的动脉粥样硬化的形成和进展。

  在本研究中OC组中渗透压的大小和改变方式和OHG组完全一致,但其诱导炎症因子表达的能力却和NG组基本一致。这就说明波动性高糖诱导炎症因子的过表达主要是由于葡萄糖水平而非渗透压的频繁更替所致。综上所述,在本研究中发现持续性高糖可以显着促进炎症因子IL-6、TNF-α和ICAM.1的表达,而波动性高糖进一步放大这一效应。这一不良效应有可能部分参与了糖尿病动脉粥样硬化的形成和加速,因此全面阻断这一低强度的冠状动脉局部炎症反应,有可能为防治糖尿病心血管并发症提供新的干预靶点。

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